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火木層孔菌中環二肽C1在制備抗禽流感H5N1病毒的藥物中的應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310401649.X

申請日:

20130906

公開號:

CN103800329B

公開日:

20160817

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:

IPC分類號:

A61K31/4985,A61P31/16,C07D487/04,A01G1/04

主分類號:

A61K31/4985,A61P31/16,C07D487/04,A01G1/04

申請人:

青島農業大學

發明人:

趙晨,宋愛榮,孔超,黃芳

地址:

266109 山東省青島市城陽區長城路700號青島農業大學生命科學學院

優先權:

CN201310401649A

專利代理機構:

代理人:

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內容摘要

本發明公開了一種從火木層孔菌Phellinus?igniarius(L?ex?Fr)Quel(裂蹄木層孔菌phellinus?linteus(Berk?et?Curt)Teng、鮑氏層孔菌Phellinus?baumii、哈蒂針層孔菌Phellinus?hartigii(Allesch?et?Schnabl)Imaz)發酵液和子實體中分離的具有抗禽流感活性的一種環二肽C1。本發明首次公開了一種環二肽的一種新活性,證明其具有抗禽流感作用。本方法較一般化合物應用的優點在于:發現了這種環二肽的新活性,具有抗禽流感病毒的作用。

權利要求書

1.環二肽C1在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用,其特征在于所述環二肽C1為六氫-7-羥基-3-(2-甲基丙基)吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4-二酮。2.如權利要求1所述的環二肽C1在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用,其特征在于環二肽C1是從火木層孔菌中提取的,提取步驟順序如下:(1)制備火木層孔菌粗提物;(2)將上述步驟(1)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌,并干燥,進行硅膠正相柱層析,用洗脫劑洗脫2-7次;(3)收集步驟(2)中最后一次洗脫液,減壓干燥,與等體積硅膠拌樣,再次進行正相硅膠層析,用洗脫劑洗脫;(4)收集上述步驟(3)中得到的洗脫液,減壓濃縮,使用甲醇溶解,甲醇凝膠柱層析,用洗脫劑洗脫,使用TLC檢測收集的洗脫液,適當合并洗脫液,減壓干燥;(5)將步驟(4)得到的產物進行反相硅膠層析,洗脫劑為甲醇和水;(6)HPLC檢測,適度合并洗脫液,減壓干燥,即為環二肽C1。3.如權利要求2所述的環二肽C1在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用,其特征在于所述火木層孔菌粗提物,由下述方法制得:(1)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內,以20~35℃溫度,搖瓶轉速為80~280r/min,pH3~8條件下,震動培養7~15天;培養中當pH值降到2.5~4時,將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中,以溫度20~35℃,發酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米,pH3~8,通氣量0.5~1.1vvm,攪拌速度100~280轉/分的條件,培養7~15天,即可得到火木層孔菌菌絲體發酵全液;(2)取步驟(1)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液,將其以常規方式減壓濃縮,使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5;(3)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(2)濃縮后的發酵液進行提取,其中,加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍,能夠使提取液中乙醇濃度達到60~90%;(4)對步驟(3)所得提取液在50~70℃條件下,加熱1~2小時;以常規方法進行分離,并通過二級過濾除去雜質,分離獲得乙醇提取液;將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮,使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10;(5)將步驟(4)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥,得火木層孔菌粗提物。4.如權利要求3所述的環二肽C1在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用,其特征在于所述液體培養基配方以克/100毫升計是:玉米淀粉1-5%葡萄糖1-5%蛋白胨0.1-0.5%酵母膏0.1-0.5%硫酸鎂0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%。5.如權利要求3所述的環二肽C1在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用,其特征在于火木層孔菌粗提物制備步驟(3)的乙醇為濃度65%-95%食用乙醇,所用體積為3-6倍體積。6.如權利要求2所述的環二肽C1在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用,其特征在于,步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠,層析硅膠為正相200-300目,洗脫劑為氯仿和/或甲醇。7.如權利要求2所述的環二肽C1在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用,其特征在于,步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積,洗脫劑為氯仿與甲醇。8.如權利要求2所述的環二肽C1在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用,其特征在于,步驟(4)中所述的凝膠為SephadexLH-20,SephadexLH-25,洗脫劑為甲醇。9.如權利要求2所述的環二肽C1在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用,其特征在于,步驟(5)所述的反相材料為C-18或者C-8,洗脫劑為甲醇:水=1:10-1:1。10.如權利要求2所述的環二肽C1在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用,其特征在于,步驟(6)所述的HPLC條件為,0min,100%A水→10min,100%甲醇,出峰時間為5.3-5.8min。

說明書

技術領域

本發明涉及一種抗禽流感H5N1病毒的火木層孔菌中活性物質的提取制備方法,尤其涉及的火木層孔菌菌種,已于2013 年8月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”, 保藏編號為CGMCC No.8108,分類名稱為火木層孔菌 Phellinusigniarius,保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所。

背景技術

通常生物學中所指的環肽是指以氨基酸肽鍵形成的化合物,在植物化學中這一概念被擴大成以酰胺鍵形成的一類化合物,因此范圍被擴大至包括有機胺類和大環生物堿類,根據成環與否分為環肽和直鏈肽。 已報道的環肽類化合物具有多方面的生物活性,包括抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗瘧、安眠、抑制血小板聚集、降壓、抑制酪氨酸酶、抑制環氧化酶、抑制脂質過氧化酶、雌性激素樣、免疫抑制等生物活性。

由于環肽的前體-直鏈肽所包含的氨基酸的數目和種類的千差萬別,造成了環肽合成方法的多樣化。對某種直鏈肽表現出高效,快速縮合作用的試劑和方法對另外一種肽鏈就可能變得低效或無效。

一種環二肽具有抗菌等多種重要的生理活性,如今,未見到有抗情流感病毒活性的報到。

發明內容

本發明公開了一種從藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的一種環二肽C1的方法。本發明首次公開了這種一種環二肽的一種新活性,證明其具有抗禽流感作用。

本方法較一般化合物應用的優點在于:發現了該種一種環二肽C1的新活性,具有抗禽流感病毒的作用。

本發明的技術方案如下:

首先制備火木層孔菌粗提物,由下述方法制得:

(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:

玉米淀粉 1-5% 葡萄糖 1-5%

蛋白胨 0.1-0.5% 酵母膏 0.1-0.5%

硫酸鎂 0.1-0.5% 磷酸二氫鉀 0.01-0.05%

(2)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內,以20~35℃溫度,搖瓶轉速為80~280r/min,pH 3~8條件下,震動培養7~15天;培養中當pH值降到2.5~4時,將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中,以溫度20~35℃,發酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米,pH 3~8,通氣量0.5~1.1vvm,攪拌速度100~280轉/分的條件,培養7~15天,即可利用火木層孔菌菌絲體發酵全液制備火木層孔菌粗提物。

(3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液,將其以常規方式減壓濃縮,使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5;

(4)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取,其中,加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍,能夠使提取液中乙醇濃度達到60~90%,乙醇優選為濃度65-95%的食用乙醇,所用體積優選為濃縮液體積的3-6倍;

(5)對步驟(4)所得提取液在50~70℃條件下,加熱1~2小時;以常規方法進行分離,并通過二級過濾除去雜質,分離獲得乙醇提取液;將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮,使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10;

(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥,得火木層孔菌粗提物。

然后從火木層孔菌粗提物中環二肽C1,步驟如下:火木層孔菌粗提物→正相硅膠層析→氯仿與甲醇梯度洗脫→TLC檢測→正相硅膠層析→甲醇凝膠層析→TLC檢測→反相硅膠層析→HPLC檢測→減壓蒸干→環二肽C1。

具體方法為:

(1)制備火木層孔菌粗提物;

(2)將上述步驟(1)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌,并干燥,進行硅膠正相柱層析,用洗脫劑洗脫2-7次;

(3)收集步驟(2)中最后一次洗脫液,減壓干燥,與等體積硅膠拌樣,再次進行正相硅膠層析,用洗脫劑洗脫;

(4)收集上述步驟(3)中得到的洗脫液,減壓濃縮,使用甲醇溶解,甲醇凝膠柱層析,用洗脫劑洗脫,使用TLC檢測收集的洗脫液,適當合并洗脫液,減壓干燥;

(5)將步驟(4)得到的產物進行反相硅膠層析,洗脫劑為甲醇和水;

(6)HPLC檢測,適度合并洗脫液,減壓干燥,即為環二肽C1。

優選的,提取步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠,層析硅膠為正相200-300目,洗脫劑為氯仿和/或甲醇。

提取步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積,洗脫劑為氯仿與甲醇。

提取步驟(4)中所述的凝膠為Sephadex LH-20,Sephadex LH-25,洗脫劑為甲醇。

提取步驟(5)所述的反相材料為C-18或者C-8,洗脫劑為甲醇:水=1:10-1:1。

提取步驟(6)所述的HPLC條件為,0min,100%A水→10min,100%甲醇,出鋒時間為5.3-5.8min。

(四)具體實施方式

實例1:

火木層孔菌粗提物,由下述方法制得:

(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:

玉米淀粉 1% 葡萄糖 1%

蛋白胨 0.1% 酵母膏 0.1%

硫酸鎂 0.1% 磷酸二氫鉀 0.01%

(2)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內,以25℃溫度,搖瓶轉速為110r/min,pH 7條件下,震動培養7天;培養中當pH值降到3時,將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中,以溫度25℃,發酵罐壓力0.1公斤/平方厘米,pH 3,通氣量0.5-1.1vvm,攪拌速度100轉/分的條件,培養7天,即可利用火木層孔菌菌絲體發酵全液制備火木層孔菌粗提物。

(3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液,將其以常規方式減壓濃縮,使其體積濃縮到原體積的1/3;

(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取,其中,加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍,能夠使提取液中乙醇濃度達到55%;

(5)對步驟(4)所得提取液在70℃條件下,加熱1小時;以常規方法進行分離,并通過二級過濾除去雜質,分離獲得乙醇提取液;將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮,使其體積濃縮到原體積的1/5;

(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥,得火木層孔菌粗提物。

將上述得物稱取300g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌,進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200目正相硅膠,柱高1m,直徑20cm,洗脫劑為分別為氯仿,氯仿:甲醇=100:1,50:1,10:1,5:1分別洗脫3個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1,Fr-2,Fr-3,Fr-4,Fr-5。將Fr-5等體積硅膠拌樣,使用硅膠為100目正相硅膠,五倍體積硅膠層析,使用的硅膠為200—300目正相硅膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。收集洗脫液,減壓濃縮,使用甲醇溶解,進行甲醇凝膠柱層析,用甲醇洗脫,使用TLC檢測收集的洗脫液,適當合并洗脫液,減壓干燥。進行反相硅膠層析,洗脫劑為甲醇:水=15%,HPLC檢測收集的洗脫液,HPLC條件為,0min,100%A水→10min,100%甲醇,出鋒時間為5.32min,適當合并,減壓干燥,再次進行甲醇凝膠層析,用甲醇洗脫,將洗脫液加壓蒸干,進行1D-HNMR核磁共振分析,頻率為400MHZ,分析結果為4.55 (ddd, J = 11.1, 6.4, 1.3 Hz, 1H), 4.49 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 4.21 (dd, J= 6.8, 3.9 Hz, 1H), 3.68 (dd, J = 12.8, 4.4 Hz, 1H), 3.46 (d, J = 12.8 Hz,1H), 3.33 (dt, J = 3.2, 1.6 Hz, 2H), 2.30 (dd, J = 13.3, 6.4 Hz, 1H), 2.15 –2.08 (m, 1H), 1.92 (ddd, J = 10.9, 7.8, 4.9 Hz, 2H), 1.54 (t, J = 8.1 Hz,1H), 1.11 – 0.80 (m, 7H).證明是為六氫-7- 羥基-3- (2- 甲基丙基)吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4 - 二酮。

(7)采用步驟(6)得到的麥角甾酮進行對MDCK細胞毒性的測定,確定其半數中毒濃度(CC50)及最大安全濃度。

在96孔板上,100μl/孔加入4×105ml-1 濃度的MDCK細胞懸液,培養24 h后,在單層細胞上分別加入不同濃度的含樣維持液,每種濃度重復3孔,并設正常細胞對照。置37℃,5%CO2培養箱中培養48 h后,棄培養液上清,100μl/孔加入5 mg.ml-1MTT 的維持液 ,繼續培養1h后,棄MTT上清,每孔加溶解液(DMSO)100μl,振蕩5-10 min,待結晶完全溶解,酶標儀測492nm處的OD值。計算出樣品的半數中毒濃度(CC50)及最大安全濃度。當加樣組的OD492值不顯著低于細胞對照組OD492時,此濃度即為樣品的最大安全濃度。

表1 環二肽C1各濃度對細胞生長的影響

由表1知:環二肽C1最大安全濃度為31.25ug/mL。

實例2:

火木層孔菌粗提物,由下述方法制得:

(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:

玉米淀粉 3% 葡萄糖 2%

蛋白胨 0.5% 酵母膏 0.5%

硫酸鎂 0.5% 磷酸二氫鉀 0.05%

(2)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內,以30℃溫度,搖瓶轉速為180r/min,pH6條件下,震動培養15天;培養中當pH值降到2.5時,將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中,以溫度30℃,發酵罐壓力0.2公斤/平方厘米,pH 3,通氣量0.5-1.1vvm,攪拌速度180轉/分的條件,培養15天,即可利用火木層孔菌菌絲體發酵全液制備火木層孔菌粗提物。

(3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液,將其以常規方式減壓濃縮,使其體積濃縮到原體積的1/5;

(4)用體積百分比為90%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取,其中,加入乙醇的量是濃縮液體積的4倍,能夠使提取液中乙醇濃度達到70%;

(5)對步驟(4)所得提取液在55℃條件下,加熱2.5小時;以常規方法進行分離,并通過二級過濾除去雜質,分離獲得乙醇提取液;將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮,使其體積濃縮到原體積的1/10;

(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥,得火木層孔菌粗提物。

將上述粗提物稱取200g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌,進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200目正相硅膠,柱高0.8m,直徑15cm,分別洗脫3個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1,Fr-2,Fr-3,Fr-4,Fr-5,。將Fr-5等體積硅膠拌樣,使用硅膠為100目正相硅膠,五倍體積硅膠層析,使用的硅膠為200—300目正相硅膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。減壓濃縮洗脫液,使用甲醇溶解,甲醇凝膠柱層析,用甲醇洗脫。使用TLC檢測收集的洗脫液適當合并,減壓蒸干,10%甲醇溶解,進行反相硅膠層析,洗脫劑為甲醇:水=15%,HPLC條件為,0min,100%A水→10min,100%甲醇,出鋒時間為5.45min,適當合并,加壓干燥,進行1D-HNMR核磁共振分析,頻率為400MHZ,分析結果為 4.55 (ddd, J = 11.1, 6.4, 1.3 Hz, 1H),4.49 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 4.21 (dd, J = 6.8, 3.9 Hz, 1H), 3.68 (dd, J = 12.8,4.4 Hz, 1H), 3.46 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 3.33 (dt, J = 3.2, 1.6 Hz, 2H), 2.30(dd, J = 13.3, 6.4 Hz, 1H), 2.15 – 2.08 (m, 1H), 1.92 (ddd, J = 10.9, 7.8,4.9 Hz, 2H), 1.54 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 1.11 – 0.80 (m, 7H).證明是為六氫-7- 羥基-3- (2- 甲基丙基)吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4 - 二酮。

(7)采用步驟(6)得到的最大安全濃度范圍內進行樣品在MDCK細胞水平上對H5N1毒株的作用,計算樣品的半數毒性濃度(CC50)和半數有效濃度(EC50),得到樣品的選擇指數(SI)=CC50/EC50,計算抑制率。

試驗中,設置正常細胞對照組(只加細胞維持液),病毒對照組(只加病毒液),質量濃度在無毒范圍內2倍稀釋4個質量濃度,設置3孔重復。 棄96孔細胞培養板孔內上清,100μl/孔加入10000TCID50病毒液(10-4.43),設置3個重復。37℃吸附2 h,棄病毒液上清,100μl/孔加入不同濃度的樣液。置37℃,5% CO2培養箱中繼續培養48h。采用MTT法測定OD492值,計算半數有效濃度(EC50)。當加樣組的OD492值顯著大于病毒對照組OD492時,表明此樣液能夠顯著抑制病毒感染MDCK,具有抗病毒的活性。

根據計算出的細胞病變率和病毒抑制率。用統計學軟件SPSS11.5的Probit回歸法,計算樣品的半數毒性濃度(CC50)和半數有效濃度(EC50),得到樣品的選擇指數(SI)=CC50/EC50。

根據下公式計算病毒抑制率:

病毒抑制率=(A-B)/(C-B)×100%

A: 樣液處理組OD值,B: 病毒對照組OD值,C: 細胞對照組OD值

表2化合物對H5N1病毒的抑制作用實驗結果

由表2知:環二肽C1在0.07ug/ml濃度下對H5N1毒株可達到最高84.5%的抑制率,此時CC50為97.07ug/ml,EC50為25.43ug/ml,SI為3.81。

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